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Désinfection UV222 du SRAS
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Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 14545 (2022) Citer cet article
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Il existe un besoin urgent de contrôles techniques fondés sur des preuves pour réduire la transmission du SRAS-CoV-2, qui cause le COVID-19. Bien que la lumière ultraviolette (UV) soit connue pour inactiver les coronavirus, les lampes UV conventionnelles contiennent du mercure toxique et émettent des longueurs d'onde (254 nm) qui sont plus dangereuses pour l'homme que les lampes à excimères de chlore au krypton émettant 222 nm (UV222). Ici, nous avons utilisé des analyses de culture et moléculaires pour fournir la première dose-réponse pour la solution SARS-CoV-2 exposée aux UV222. Les tests de culture (infectiosité de la plaque pour l'hôte Vero) ont démontré une désinfection de plus de 99,99 % du SRAS-CoV-2 après une dose d'UV222 de 8 mJ/cm2 (constante de vitesse de pseudo-premier ordre = 0,64 cm2/mJ). Immédiatement après le traitement UV222, les tests RT-qPCR ciblant le gène de la nucléocapside (N) ont démontré une contribution d'environ 10 % des dommages du gène N à la cinétique de désinfection, et un test ELISA ciblant la protéine N n'a démontré aucune contribution des dommages de la protéine N à la cinétique de désinfection. Les résultats moléculaires suggèrent que d'autres dommages aux gènes et aux protéines ont davantage contribué à la désinfection. Après 3 jours d'incubation avec des cellules hôtes, les cinétiques RT-qPCR et ELISA du SRAS-CoV-2 traité par UV222 étaient similaires à la cinétique de culture, suggérant la validité de l'utilisation de dosages moléculaires pour mesurer la désinfection UV sans culture. Ces données fournissent une cinétique de désinfection quantitative qui peut éclairer la mise en œuvre de l'UV222 pour prévenir la transmission du COVID-19.
Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est l'agent étiologique de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), une maladie infectieuse récemment apparue incurable. Le SRAS-CoV-2 se propage principalement d'une personne à l'autre lorsque les muqueuses (par exemple, les poumons, les yeux) sont exposées à des virus en suspension dans l'air qui ont été émis par des individus infectés sous forme de particules de différentes tailles1, 2. L'infection entraîne une évolution variable de la maladie affectant plusieurs systèmes organiques (respiratoire, cardiaque, neurologique et gastro-intestinal); pour cette raison, les symptômes de la COVID-19 sont variables et comprennent une infection asymptomatique, de la fièvre, de la toux, de la dyspnée, des malaises, des nausées, une agueusie/anosmie, un délire et la mort. Un certain nombre de thérapies antivirales et dirigées par l'hôte ont été ou sont explorées en tant que traitements COVID-193–15. Ces traitements et vaccins incitent à l'optimisme pendant la pandémie actuelle de COVID-19, qui a tué à ce jour près de 2 millions de personnes ; cependant, même après que les vaccins seront devenus largement disponibles, la distanciation sociale, les équipements de protection individuelle (EPI), y compris les masques faciaux et d'autres solutions techniques qui limitent la transmission continueront d'être nécessaires dans un avenir prévisible pour cette maladie et d'autres maladies infectieuses émergentes3. La chimie de surface d'ingénierie de l'EPI contre la protéine SARS-CoV-2 Spike a récemment été explorée4.
L'irradiation aux ultraviolets (UV) est un moyen efficace d'inactiver un certain nombre de virus respiratoires, notamment le coronavirus humain OC43 (HCoV-OC43, une cause du rhume5) et le SARS-CoV (agent étiologique de l'épidémie de SRAS de 20026–8). Les UV sont couramment appliqués pour la désinfection de l'air des pièces supérieures, dans les systèmes CVC et dans les purificateurs d'air et de surface autonomes. Cependant, la faisabilité de l'utilisation des UV à un niveau généralisé et fondé sur des preuves pour minimiser la transmission du SRAS-CoV-2 est actuellement limitée par deux raisons : (1) les lampes UV conventionnelles à basse pression à base de mercure ne sont pas pratiques dans de nombreux contextes car elles sont dangereux pour la santé humaine (l'émission de la longueur d'onde de 254 nm provoque le cancer de la peau9 et la cataracte10) et l'environnement (le mercure provenant de la rupture d'ampoules de lampes à quartz fragiles est toxique11), (2) la cinétique de réponse à la dose UV nécessaire pour inactiver le SRAS-CoV-2 est inconnue . Si ces deux défis devaient être surmontés, l'utilisation des UV pour inactiver le SRAS-CoV-2 dans des environnements à fort potentiel de transmission (par exemple, les établissements de soins collectifs, les maisons de convalescence, les salles d'attente des hôpitaux, les cabines d'avion) serait une solution d'ingénierie pratique et facilement déployée. solution pour augmenter les mesures prophylactiques actuelles (distanciation sociale, masques faciaux, vaccins). En raison d'un regain d'intérêt et de l'application des UV dans divers lieux publics, il est urgent de comprendre la cinétique dose-réponse du SRAS-CoV-2 au rayonnement UV pour éclairer les décisions de conception technique qui équilibrent le risque pour les yeux et la peau des UV exposition avec risque d'infection par transmission virale.
Ici, nous démontrons la cinétique dose-réponse du SRAS-CoV-2 dans un liquide après exposition à une lumière UV principalement de 222 nm émise par une lampe excimère au krypton-chlore (KrCl) (excilampe) filtrée pour réduire la transmission de longueurs d'onde plus nocives > 240 nm. L'émission à plus faible longueur d'onde (222 nm) n'est ni cancérigène dans les modèles de peau humaine ou chez les rongeurs12, ni ne provoque de lésions cornéennes aiguës chez les rongeurs13. De plus, la longueur d'onde de 222 nm émise par les lampes excilampes KrCl est intrinsèquement plus efficace pour la désinfection14, les dommages aux acides nucléiques15 et les dommages aux protéines16, 17 que 254 nm émis par les lampes à mercure à basse pression en raison d'une plus grande absorbance des biomolécules cibles à des longueurs d'onde inférieures. Le krypton et le chlore dans les excilampes KrCl sont beaucoup moins toxiques que le mercure, et il a déjà été démontré que les excilampes KrCl sont compétitives en termes d'efficacité électrique avec les lampes au mercure qui ont de nombreuses années de développement et d'optimisation de produits18. Pour fournir une quantification plus sûre des doses-réponses sans nécessiter la prolifération virale qui est requise dans les tests standard basés sur la culture, les dommages à la protéine de la nucléocapside et au gène N ont été mesurés après le traitement UV222 à l'aide de tests commerciaux. Nos résultats démontrent que lorsqu'une solution aqueuse de SARS-CoV-2 pathogène est exposée à la lumière UV222 émise par une excilamp Kr-Cl, son infectiosité et son intégrité sont atténuées de manière dépendante de la dose UV, telle que mesurée par la culture et les dosages moléculaires. Ces premières doses-réponses de désinfection UV222 démontrent la faisabilité des UV comme approche pour inactiver le SRAS-CoV-2.
Le SRAS-CoV-2, isolat USA-WA1/2020, a été obtenu auprès du référentiel de ressources de recherche sur la biodéfense et les infections émergentes (ressources BEI, lot n° 70034262) et stocké et cultivé dans le laboratoire de niveau 3 de biosécurité de l'Ohio State University (protocole IBC n° 2020R00000046) . Le stock viral utilisé dans cette étude a été établi en décongelant le lot, en le diluant au 1/10 000 dans du DMEM incomplet (Gibco Cat# 11995-065, additionné de 4,5 g/L de d-glucose, 110 mg/L de pyruvate de sodium) et en ajoutant dans des flacons T175 de cellules Vero confluentes (ATCC clone E6) pendant une période d'incubation d'une heure (37 °C, 5 % de CO2), après quoi le surnageant a été retiré et remplacé par du DMEM complet (cDMEM ; DMEM comme ci-dessus plus 4 % de chaleur -sérum bovin fœtal inactivé). Ces flacons T175 ont été incubés pendant 3 jours (37°C, 5% CO2) pour propager le virus infectieux. A la fin de cette période, une inspection visuelle des flacons au microscope optique a démontré que la quasi-totalité des cellules Vero étaient mortes. Les surnageants de chacun des flacons T175 étaient présumés contenir des virus infectieux à ce stade, ont été soigneusement transférés et combinés dans un conique de 50 ml, centrifugés à basse vitesse pour éliminer les débris cellulaires, aliquotés dans des tubes de microcentrifugeuse, congelés et stockés à - 80 ° C Le titre de virus vivant dans les aliquotes congelées a été déterminé comme étant d'environ 107 unités formant plaque (PFU) par ml en utilisant une version modifiée du test de plaque développé par le laboratoire Diamond19 et décrit ci-dessous.
La source lumineuse UV222 (USHIO Care222®) est une excilampe KrCl filtrée optiquement pour réduire l'émission > 240 nm. La source UV a été allumée pour se réchauffer pendant 15 minutes avant toute mesure d'irradiance ou spectrale ou irradiation. Des procédures standardisées ont été suivies pour la réalisation d'études de désinfection par faisceau quasi collimaté20 et le calcul des doses d'UV polychromatiques21. Le spectre d'émission de la source UV222 a été mesuré à l'aide d'un spectroradiomètre Ocean Optics HDX UV-Vis calibré et traçable NIST avec une fibre de 455 µ extrêmement résistante à la solarisation et un détecteur correcteur de cosinus diffusant Spectralon. Les données spectrales brutes du logiciel OceanView ont été interpolées à des longueurs d'onde entières à l'aide de la fonction FORECAST dans Microsoft Excel et relativisées à l'émission maximale à 222 nm pour être utilisées dans les calculs de dose (Fig. 1 et Fig. S1 supplémentaire). L'irradiance UV-C incidente totale a été mesurée à l'aide d'un radiomètre International Light Technologies (ILT) 2400 avec un détecteur de store solaire SED 220/U, un diffuseur W Quartz Wide Eye pour la correction du cosinus et un étalonnage traçable NIST de la réponse d'irradiance maximale. Pour la mesure de l'irradiance, la valeur d'étalonnage de la longueur d'onde maximale a été saisie manuellement en tant que facteur du radiomètre. L'irradiance incidente a été mesurée avec le plan de détection du radiomètre centré à la hauteur et à l'emplacement de la surface de l'échantillon pendant les expositions aux UV, et corrigée de plusieurs facteurs pour déterminer l'irradiance moyenne à travers la profondeur de l'échantillon. La non-uniformité spatiale de l'émission a été prise en compte pour chaque test en mesurant l'irradiance par incréments de 0,5 cm du centre au bord de la boîte de Pétri et relativisée pour déterminer un facteur de Pétri, qui était toujours > 0,9. La réponse spectrale typique du détecteur a été obtenue à partir de l'ILT et utilisée pour calculer le facteur de radiomètre intégré sur l'émission de la lampe, qui était de 0,9971. Comme précédemment22, le facteur de réflexion pour l'eau à la longueur d'onde maximale de 222 nm a été supposé être de 0,9726. Le facteur de divergence a été déterminé chaque jour d'expérience en tenant compte de la distance entre la lampe et la surface de l'échantillon et de la profondeur de l'échantillon et était toujours > 0,9. Le facteur eau a été déterminé chaque jour d'échantillonnage par le rapport entre l'éclairement énergétique incident et l'éclairement énergétique moyen intégré à travers la profondeur de l'échantillon après absorption spécifique à la longueur d'onde. L'absorbance UV-vis des stocks de travail de virus (préparés frais pour chaque test) a été mesurée dans l'enceinte de sécurité biologique à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop ™ OneC via le socle de microvolume pour les longueurs d'onde de 200 à 295 nm et la cuvette en quartz de 1 cm pour les longueurs d'onde supérieures à 195 nm. Les spectres d'absorbance du stock de travail pour chaque test sont présentés sur les Fig. 1 et S1. Après ces ajustements à l'irradiance incidente au centre de l'échantillon, l'irradiance moyenne a été utilisée pour calculer les temps d'exposition (max : 15 min ; min : 15 s) pour des doses UV prédéterminées (0–40 mJ/cm2). Trois tests de désinfection ont été réalisés avec des temps d'exposition allant jusqu'à 115 s pour des doses UV jusqu'à 2,7 mJ/cm2, jusqu'à 856 s pour des doses UV jusqu'à 40 mJ/cm2 et jusqu'à 1260 s pour des doses UV jusqu'à 30 mJ/cm2 , respectivement. (Résumé dans le tableau supplémentaire S1).
(A) L'émission spectrale brute de 200 à 300 nm de l'excilamp KrCl filtré (USHIO Care222®) a été interpolée et relativisée à l'émission maximale à 222 nm pour une utilisation dans les calculs de dose UV. (B) Le spectre d'absorbance de 200 à 300 nm de SARS-CoV-2 à ~ 105 PFU/mL dans cDMEM a été mesuré pour chacun des trois tests biologiquement indépendants à utiliser dans les calculs de dose UV. Les spectres d'émission et d'absorbance étendus de 200 à 800 nm sont présentés dans la Fig. S1 supplémentaire.
Toutes les mesures UV, la préparation des échantillons, les traitements UV et la manipulation ultérieure des échantillons traités ont été effectués dans une enceinte de sécurité biologique. Le jour de chacun des trois tests biologiquement indépendants pendant que la source UV se réchauffait et que des mesures étaient prises pour les calculs de dose, des aliquotes de SARS-CoV-2 (précédemment titrées à 107 PFU/mL) ont été diluées dans du cDMEM pour faire une « solution mère de travail ». " avec un titre cible de 105 PFU/mL. Pour chaque dose d'UV testée, 3 ml de la solution mère de travail ont été pipetés dans une boîte de culture tissulaire en polystyrène de 3,7 cm2 et de 3,5 cm de diamètre (VWR Catalog # 82050-538) avec un micro-agitateur stérile revêtu de Téflon (VWR Catalog # 58948 -353) et placé sous la lumière UV sur une petite plaque d'agitation pour obtenir un mélange au repos tout en bloquant la lumière UV avec un obturateur. Après avoir retiré le couvercle de la boîte de culture tissulaire, l'obturateur a été retiré pour exposer l'échantillon à la lumière UV pendant le temps d'exposition calculé correspondant à la dose UV prédéterminée avant de remplacer l'ouverture pour mettre fin à l'exposition aux UV. Immédiatement après, le milieu traité a été transféré dans un tube à centrifuger en polypropylène stérile de 15 ml (VWR) et utilisé pour les tests décrits ci-dessous. Les stocks de travail pour les échantillons non traités ont été placés sur la plaque d'agitation pendant une durée représentative avec la lampe éteinte avant le transfert dans un tube à centrifuger (0 mJ/cm2).
Des tests de plaque ont été utilisés pour déterminer les PFU/mL d'échantillons avant le traitement UV (0 mJ/cm2) et après le traitement UV (toutes les autres doses UV). Le test de plaque utilisé pour cette étude est une modification de celui qui a été initialement développé et rapporté par Case et al.19 et est répertorié ici en tant qu'ÉTAPES 1 à 5. (ÉTAPE 1) Au moins 18 h avant le test, des plaques à 12 puits ont été ensemencées avec un nombre suffisant de cellules Vero pour que chaque puits soit confluent au début du test ; les plaques ont été incubées pendant une nuit à 37°C. (ÉTAPE 2) Le jour de l'essai (jour 0), des dilutions en série de milieux contenant des virus (par exemple, des échantillons de virus traités aux UV) ont été préparées dans du cDMEM (1:101, 1:102, 1:103, 1:104) et réchauffé à 37 °C. (ÉTAPE 3) Le milieu de chaque puits de la plaque à 12 puits a été délicatement retiré à l'aide d'une pipette et remplacé par 500 uL de chaque dilution en série de virus, le volume étant pipeté sur le côté du puits afin de ne pas perturber la monocouche de cellules Vero. (ÉTAPE 4) La plaque a été incubée pendant une heure à 37 °C, 5 % de CO2. (ÉTAPE 5) Au cours de cette période d'incubation de l'infection, une solution comprenant un mélange 1:0,7 de cDMEM et 2 % de méthylcellulose (viscosité : 4 000 cP) a été fraîchement préparée et réchauffée à 37 °C dans un bain-marie. Après la période d'incubation d'infection d'une heure, le surnageant a été retiré de chaque puits et remplacé par 1 ml du mélange cDMEM/méthylcellulose réchauffé. (ÉTAPE 6) La plaque de culture a ensuite été remise dans l'incubateur et laissée au repos pendant 3 jours. Le dernier jour (jour 3), le mélange cDMEM/méthylcellulose a été retiré de chaque puits, les cellules ont été fixées avec du para-formaldéhyde à 4 % dans du PBS (20 min, température ambiante), lavées avec du PBS et colorées avec du cristal violet à 0,05 % (dans 20% de méthanol). Après rinçage des plaques avec de l'eau distillée, les plaques ont été séchées et les plaques ont été comptées sous un microscope optique à un grossissement de 20x.
Le test d'excroissance virale utilisé pour cette étude est identique au test de plaque décrit ci-dessus, à l'exception qu'après l'étape 4, le support chargé de virus a été remplacé par 1 mL de cDMEM chaud (au lieu d'un mélange cDMEM/méthylcellulose). Ensuite, la plaque de culture a été remise dans l'incubateur et laissée au repos pendant 3 jours. Le dernier jour, les surnageants cellulaires de chaque puits ont été collectés, transférés dans un tube de microcentrifugeuse, centrifugés à basse vitesse pour éliminer les débris cellulaires (1000 × g, 10 min), aliquotés dans des tubes de microcentrifugeuse, congelés et stockés à - 80 ° C . Des aliquotes ont ensuite été utilisées pour la mesure quantitative par PCR en temps réel (qRT-PCR) des copies du gène de la nucléocapside (N) du SRAS-CoV-2, ainsi que pour la détermination ELISA des concentrations de protéines SARS-CoV-2 N.
La PCR quantitative (qPCR) a été utilisée pour quantifier le gène SARS-CoV-2 N directement dans des extraits d'ARN d'échantillons avant traitement UV (0 mJ/cm2) et après traitement UV (toutes les autres doses UV) (échantillons "Jour 0"), et dans des extraits d'ARN d'aliquotes de surnageant cellulaire provenant d'essais d'excroissance (échantillons "Jour 3"). L'ARN a été extrait des échantillons à l'aide de la méthode QIAamp Viral RNA (Qiagen) et converti en ADNc à l'aide de la méthode de synthèse du premier brin SuperScript IV avec des amorces hexamères aléatoires (Invitrogen). L'ADNc a ensuite été amplifié avec le "jeu d'amorces N1" et les conditions de PCR associées initialement développées par les Centers for Disease Control23. Ces amorces sont spécifiques des nucléotides 13 à 85 du gène N (NCBI Ref Seq NC_045512.2) et génèrent un amplicon court (72 nt) : 2019-nCoV_N1-F (forward) primer, 5′-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3′ ; Amorce 2019-nCoV_N1-R (inverse), 5′-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATTCG-3′. L'ADNc a été amplifié par PCR dans un test PCR quantitatif (q-PCR) comprenant 1X TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), les amorces sens/sens N1 décrites ci-dessus (concentration finale : 500 nM) et une sonde N1 TaqMan conjuguée à un fluorophore (5′-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGACC-BHQ1-3′; concentration finale 125 nM). Les tests q-PCR ont été exécutés sur un système de PCR en temps réel BioRad CFX Connect pour déterminer les valeurs CT à partir des échantillons et des normes. Une courbe standard a été générée pour l'ensemble d'amorces N1 en exécutant des dilutions en série sur chaque plaque d'ARN transcrit in vitro converti en ADNc reliant les nombres de copies du gène N aux valeurs CT. Pour générer cette norme, l'ARN a été extrait d'une aliquote de notre stock SARS-CoV-2 et converti en ADNc avant l'amplification du gène N à l'aide du jeu d'amorces N1 comme décrit ci-dessus. L'amplicon a été visualisé par électrophorèse sur gel d'agarose, extrait sur gel et cloné/ligaturé dans le vecteur plasmidique pCR II-TOPO (Invitrogen), en aval du promoteur T7. Les produits de ligature ont été transformés dans E. coli et des mini-préparations de colonies sélectionnées au hasard ont été criblées par PCR pour la présence d'insert. Un seul clone a ensuite été utilisé pour produire de l'ARN du gène N transcrit in vitro (IVT), un réactif nécessaire à la mesure précise du nombre de copies de gènes, à l'aide de la méthode de synthèse d'ARN HiScribe T7 Quick High Yield (New England Biolabs). Après avoir traité l'ARN IVT avec de la DNase et effectué une réaction de nettoyage, la concentration d'ARN a été déterminée via Nanodrop. Les copies des transcrits d'ARN du gène N simple brin par µL ont été déterminées par l'équation suivante : [concentration d'ARN (mesure de la nanogoutte, ng/µL) × nombre d'Avogadro (6,02 × 1023)]/[poids moléculaire prévu du transcrit (23 kDa) × 109]. Des dilutions en série d'ARN IVT ont été réalisées (plage : 1013⟶10–1 copies/µL), converties en ADNc comme ci-dessus et utilisées comme étalons dans le dosage du nombre de copies du gène N décrit ci-dessus.
La qPCR a été utilisée pour quantifier le gène SARS-CoV-2 N dans des extraits d'ARN d'échantillons de stocks de travail avant le traitement UV (0 mJ/cm2) et immédiatement après le traitement UV (toutes les autres doses UV) (échantillons "Jour 0"). L'ARN a été extrait des échantillons et converti en ADNc comme décrit ci-dessus. L'ADNc a ensuite été quantifié à l'aide d'une combinaison des ensembles d'amorces CDC 2019 N1 et N2 pour générer un amplicon long (944 nt) : amorce 2019-nCoV_N1-F (sens), 5′-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3′ ; Amorce 2019-nCoV_N2-R (inverse), 5′-GCGCGACATTCCGAAGAA-3′. Les amorces ont été obtenues à partir d'IDT et les concentrations finales étaient de 500 nM, dans 10 ml de SsoFast EvaGreen Supermix (BIO-RAD) et 7,75 ml d'eau sans nucléase (Fisher Scientific) et 2 ml de matrice d'ADNc. Les réactions d'un volume total de 20 ml ont été exécutées au moins en double technique sur un système de PCR en temps réel Applied Biosystems QuantStudio 7 pour déterminer les valeurs CT à partir des échantillons et des étalons. Pour le jeu d'amorces N1-2, le standard consistait en des dilutions en série du plasmide de contrôle d'ADN double brin du gène N complet (2019-nCoV_N_Positive Control, IDT).
La concentration de protéine N dans les échantillons avant traitement UV (0 mJ/cm2) et après traitement UV (toutes les autres doses UV) (échantillons "Jour 0") et les aliquotes de surnageant cellulaire des tests de croissance (échantillons "Jour 3") ont été déterminées en utilisant la méthode du kit de dosage quantitatif de l'antigène SARS-CoV-2 (ELISA) (ADS Biotec). Des contrôles d'étalonnage fournis par le fabricant ont été utilisés pour établir une courbe standard liée à la concentration de protéine N et à l'absorbance de l'échantillon (longueur d'onde : 450 nm). Les valeurs en dehors de la courbe standard ont été diluées davantage et réexécutées si nécessaire. Le signal positif pour le SRAS-CoV-2 était de 2,7 × 105 ± 9,8 × 104 pg/mL dans les échantillons de virus non traités au jour 0 et de 1,4 × 108 ± 3,0 × 108 pg/mL dans les surnageants de culture cellulaire incubés avec des échantillons de virus non traités au jour 3 Aucune protéine N n'a été détectée dans les surnageants de culture cellulaire de contrôle négatif qui ont été incubés sans échantillons de virus.
Les graphiques ont été préparés à l'aide des programmes GraphPad Prism ou Microsoft Excel ; des analyses statistiques (y compris la régression à l'aide du complément d'analyse de données pour déterminer l'erreur standard des coefficients de régression) ont été effectuées à l'aide du logiciel fourni avec ces programmes. La réduction de Log10 (LR) a été calculée comme log10(No/N), où N était le PFU viral/mL dans le test de plaque, N copies de gène/µL dans les tests qPCR pour l'amplicon N1 court ou l'amplicon N1-2 long, ou Concentration de protéine N en pg/mL dans le test ELISA après exposition à une dose UV222 donnée, et No était la concentration initiale. Le niveau de réplication dans cette étude était de trois tests biologiquement indépendants, avec au moins des doublons techniques pour chaque test. Le résumé des réplicats biologiques et techniques pour toutes les cultures et les essais moléculaires est présenté dans le tableau S2.
La dose-réponse de l'infectivité virale UV222 a été caractérisée par une cinétique de décroissance exponentielle (Fig. 2). Les résultats représentatifs du test de plaque pour l'expérience 2 sont présentés dans la Fig. S2 supplémentaire. À un titre viral initial moyen de 6,51 × 104 PFU/mL, la pseudo constante de vitesse de premier ordre pour la désinfection virale était de − 1,48 cm2/mJ (R2 = 0,89). Exprimée en tant que réduction log10 (LR) de l'infectivité virale après exposition à une dose UV donnée, la constante de vitesse linéaire était de 0,64 cm2/mJ (R2 = 0,95), ce qui équivaut à un D90 (dose pour 1 log10 ou 90 % d'inactivation) = 1,6 mJ/cm2. Les plages de doses et la confluence initiale des cellules Vero n'étaient suffisantes que dans la réplique expérimentale du test 3 pour quantifier une réponse à la dose. Cependant, dans le test 2, le titre viral initial moyen de 3,54 × 104 PFU/mL dans les échantillons non traités a été réduit en dessous de la détection par la première dose testée de 10 mJ/cm2, ce qui équivaut à un LR d'au moins 4,25 logs. Ces résultats étaient également cohérents avec les résultats qualitatifs du test 1, où les cellules Vero semblaient pour la plupart mortes dans les échantillons non traités, semblaient de plus en plus saines à des doses de 0,7 et 1,4 mJ/cm2 et semblaient saines à des doses supérieures à 2 mJ/cm2.
(A) Les titres de SRAS-CoV-2 mesurés par dosage de plaque 3 jours après l'exposition de l'échantillon à chaque dose d'UV222 (cernes) ont été ajustés avec un modèle exponentiel commençant au titre viral initial moyen (0 mJ/cm2) de 6,51 × 104 PFU /mL jusqu'à et y compris 8 mJ/cm2 où PFU/mL a d'abord chuté en dessous de la limite de détection du test (LD) de 2 PFU/mL (cercles vides). Les barres d'erreur représentent l'écart type d'au moins deux répétitions techniques. (B) Les réductions SARS-CoV-2 log10 (LR) des titres viraux après exposition à chaque dose d'UV222 (cercles noirs) ont été calculées à partir de (A) et ajustées avec un modèle linéaire forcé à travers l'origine à 0 mJ/cm2 par des réponses jusqu'à jusqu'à et y compris 8 mJ/cm2 où le LR a d'abord dépassé le DL de 4,51 logs (cercles vides). Les résultats représentatifs du test de plaque pour l'expérience 2 sont présentés dans la Fig. S2 supplémentaire.
Dans tous les tests, la détection du SRAS-CoV-2 dans le test N1 était de 10,66 ± 0,27 log10 copies/µL dans les cultures cellulaires infectées par un virus non traité (0 mJ/cm2), 5,06 ± 0,78 log10 copies/µL dans les surnageants de culture cellulaire non infectés, 5,49 log10 copies/µL dans le contrôle négatif d'extraction d'ARN, 3,66 ± 0,23 log10 copies/µL dans les contrôles de réaction RT-qPCR sans matrice (données de concentration et courbes standard présentées dans les Fig. S3 et S5 supplémentaires). En raison de l'amplification des contrôles négatifs d'extraction d'ARN (valeurs CT répertoriées dans le tableau S3), nous avons exclu les points avec des valeurs CT supérieures aux valeurs CT du contrôle négatif d'extraction d'ARN pour les échantillons, les échantillons de contrôle et les courbes standard. Malgré ce bruit de fond, les doses-réponses étaient encore perceptibles car le bruit de fond est annulé par le calcul du LR. De plus, les données du test d'excroissance au jour 3 ont démontré une augmentation du signal de près de 3 log10 copies/µL dans les cultures cellulaires infectées par le virus non traité (0 mJ/cm2), allant de 9,7 à 9,9 log10 copies/µL le jour 0 à 12–12,6 log10 copies/ µL le jour 3. Cela augmente la capacité à détecter des concentrations initiales inférieures en raison de la propagation du virus infectieux et, par conséquent, diminue la limite de détection LR pour fournir une meilleure estimation de la réponse à la dose UV.
Pour le court amplicon couvrant la région N1 du gène N (CDC 2019), les dommages de l'ARN viral en réponse aux UV222 immédiatement après le traitement ("Jour 0") ont également été caractérisés par une cinétique de décroissance exponentielle (Fig. 3A). Exprimée en LR de N1 copies/µL dans les réactions qPCR après exposition à une dose UV donnée, la constante de vitesse linéaire était de 0,049 ± 0,005 cm2/mJ (pente ± erreur standard, R2 = 0,92). La dose-réponse N1 a été modélisée en utilisant la région linéaire entre 0 et 20 mJ/cm2 pour éviter les traînées dans la dose-réponse. En incluant uniquement des doses allant jusqu'à 10 mJ/cm2 comme pour le test de plaque, la pente (0,07) de la dose-réponse aux dommages du gène N1 au jour 0 était supérieure aux doses allant jusqu'à 20 mJ/cm2 (0,05) alors que R2 était le même ( 0,92). La courbe dose-réponse entre 0 et 10 mJ/cm2 et entre 0 et 20 mJ/cm2 est représentée sur les Fig. S4 et 3A séparément. Par rapport à la constante de vitesse LR de l'infectivité du SRAS-CoV-2 mesurée par test de plaque, la constante de vitesse LR des dommages au gène N mesurée par N1 qPCR était environ dix fois inférieure.
(A) Dommages au gène SARS-CoV-2 N immédiatement après le traitement UV (jour 0) et après incubation d'échantillons avec des cellules hôtes (jour 3) exprimés en réduction log10 des copies N1 (amplicon court)/µL dans les réactions qPCR. (B) Dommages au gène SARS-CoV-2 N immédiatement après le traitement UV (jour 0) exprimés en réduction log10 des copies N1-2 (long amplicon)/µL dans les réactions qPCR. (C) Concentration de protéine SARS-CoV-2 N mesurée par ELISA exprimée en réduction log10 de la concentration de protéine N (pg/mL) dans les échantillons immédiatement après le traitement UV (jour 0) et après incubation des échantillons avec des cellules hôtes (jour 3). Les réductions log10 du SRAS-CoV-2 de l'amplicon N1, de l'amplicon N1-2 ou de la protéine N par rapport à la dose d'UV222 ont été ajustées avec un modèle linéaire forcé à travers l'origine à 0 mJ/cm2 par des réponses allant jusqu'à 20 mJ/cm2 indiqué par cercles remplis. Les points non inclus dans les modèles sont indiqués par des cercles vides.
Pour la dose-réponse N1 après 3 jours dans le test d'excroissance ("Jour 3") pour des doses allant jusqu'à 0–20 mJ/cm2 sur la Fig. 3A, la constante de vitesse linéaire était de 0,230 ± 0,033 cm2/mJ (pente ± erreur standard, R2 = 0,78). Bien qu'une dose-réponse positive soit apparente et que la pente soit plus proche du test de plaque (indiquant une meilleure capacité à prédire la réponse à la dose de test de plaque avec une culture cellulaire combinée avec qPCR), la variabilité accrue introduite par la culture cellulaire a diminué la force de la régression.
Pour le long amplicon couvrant à la fois les régions N1 et N2 du gène N (CDC 2019), les dommages à l'ARN viral en réponse aux UV222 immédiatement après le traitement ("Jour 0") étaient également caractérisés par une décroissance exponentielle (Fig. 3B). La constante de vitesse linéaire pour la dose LR par rapport à la dose d'UV222 était de 0,056 ± 0,005 (pente ± erreur standard, R2 = 0,94). Par rapport à la constante de vitesse LR pour l'infectivité du SRAS-CoV-2 mesurée par test de plaque, la constante de vitesse LR des dommages au gène N mesurée par N1-2 qPCR était environ dix fois inférieure. Cette similitude indique que l'augmentation de la longueur de l'amplicon n'a pas augmenté la capacité à détecter les dommages génétiques qui sont en corrélation avec la perte d'infectiosité virale. Dans tous les tests, le signal positif pour le SRAS-CoV-2 dans le test N1-2 était de 4,7 ± 0,1 log10 copies/µL dans les cultures cellulaires infectées par un virus non traité, non détecté dans les surnageants de culture cellulaire non infectés, et de 0,08 ± 1,4 copies/µL dans aucun modèle de contrôle de réaction RT-qPCR (données de concentration et courbes standard illustrées dans les figures supplémentaires S3 et S5). Étant donné que le test d'amplicon long a été utilisé pour étudier le potentiel d'amélioration de la mesure de la réponse à la dose de désinfection sans culture, aucun échantillon du jour 3 n'a été analysé.
Pour la Fig. 3C, bien qu'aucune dose-réponse n'ait été observée pour la LR de la protéine N par rapport à la dose d'UV222 immédiatement après le traitement ("Jour 0") pour des doses allant jusqu'à 40 mJ/cm2 (0,002 ± 0,001 cm2/mJ, pente ± erreur standard, R2 = 0,21), une réponse à la dose plus forte a été observée dans les surnageants de culture cellulaire du jour 3 pour des doses allant jusqu'à 20 mJ/cm2 (0,243 ± 0,028 cm2/mJ, pente ± erreur standard, R2 = 0,21) (Fig. 3C). Dans tous les tests, le signal positif pour le SRAS-CoV-2 dans le dosage de la protéine N était de 2,69 × 105 ± 9,83 × 104 pg/mL dans les échantillons de virus non traités au jour 0, 1,41 × 108 ± 2,99 × 108 dans les surnageants de culture cellulaire au jour 3 infecté par un virus non traité et en dessous de la détection dans les surnageants de culture cellulaire non infectés (données de concentration et courbes standard présentées dans les figures supplémentaires S3 et S5).
Cette étude fournit la première cinétique rigoureuse de réponse à la dose UV222 pour le SRAS-CoV-2 en solution aqueuse, mais il y a des limites qui doivent être reconnues. Plus important encore, cette étude a été menée à l'aide de virions en suspension dans une solution aqueuse. Ce n'est qu'un point de départ pour quantifier la cinétique dose-réponse pour la désinfection par virus aéroporté qui est la plus pertinente pour ce virus, où de nombreux facteurs tels que la température, l'humidité, la dynamique du flux d'air et les spécificités du réacteur UV auront un impact sur les réponses dose. Des études antérieures comparant la cinétique de désinfection des agents infectieux dans l'air à une humidité relative croissante à celles dans l'eau24–29 indiquent que ces réponses à la dose d'eau peuvent présenter une estimation prudente de la cinétique de désinfection dans l'air, car l'humidité dans de nombreux environnements intérieurs est conditionnée pour réduire la persistance des agents infectieux.
Une limitation supplémentaire de cette étude liée à l'application d'UV222 dans les environnements intérieurs est que l'impact de la désinfection de toute production d'ozone par les longueurs d'onde UV sous vide potentiellement émises par l'excilamp KrCl n'a pas été mesuré, mais peut probablement être négligé en raison des débits d'air élevés dans l'enceinte de biosécurité et Installation BSL3. Les impacts négatifs sur la qualité de l'air et la dégradation des matériaux de construction par l'ozone potentiellement générés par ces lampes, ainsi que les risques potentiels pour la santé et la solarisation des matériaux de construction à partir de longueurs d'onde inférieures à 240 nm et l'émission non nulle à des longueurs d'onde supérieures à 240 nm (Fig. S1 supplémentaire), devraient également être pris en compte lors de la pesée des avantages de la réduction de la transmission des maladies infectieuses par les UV222 pour le COVID-19 et d'autres maladies infectieuses.
Compte tenu de ces limitations, ces données fournissent une base solide pour le développement et l'application futurs de l'UV222 pour réduire la transmission virale aéroportée. L'UV222 est au moins 4,2 fois plus sûr pour l'exposition humaine (les valeurs limites d'exposition humaine aux UV avant les récentes mises à jour étaient de 25 mJ/cm2 et 6 mJ/cm2 à 222 et 254 nm, respectivement29) et au moins 1,3 fois plus efficace pour désinfecter le SRAS -CoV-2 (le D90 que nous avons observé pour UV222 (1,6 mJ/cm2) est inférieur à celui récemment prédit par la modélisation génomique pour UV254 (2,15 mJ/cm2)30 et D90 (2,5 mJ/cm2) pour UV254 observé par Lo et al .31). Une étude récente appliquant des UV222 continus à des doses inférieures à ces valeurs limites pour traiter d'autres coronavirus aéroportés a démontré plusieurs logs d'inactivation en quelques minutes32. Cet avantage à faible longueur d'onde pour la désinfection du SRAS-CoV-2 est cohérent avec une étude où l'UV222 était plus de deux fois plus efficace que l'UV254 contre le bactériophage MS222 et avec d'autres spectres d'action virale indiquant une plus grande sensibilité à 222 nm qu'à 254 nm14,33. Ma et al. ont exploré la cinétique de désinfection UV du SRAS-CoV-2 dans une solution aqueuse à couche mince avec différentes longueurs d'onde de 222 nm à 282 nm et UV222 avait les meilleures performances34. Le débit constant linéaire de 1,42 cm2/mJ est supérieur à la valeur rapportée par notre étude. Cela pourrait s'expliquer par notre absorbance élevée de l'échantillon à 222 nm par rapport à la leur (0,05 cm−1), leur configuration expérimentale différente testant la désinfection en couches minces plutôt qu'en solution aqueuse, ou notre modélisation dose-réponse qui incluait la dose la plus faible pour dépasser la plaque limite de détection du test (Fig. 2). Une revue récente35 a prédit que le D90 médian pour la désinfection des coronavirus par UV254 serait de 3,7 mJ/cm2. Nos résultats et ces prédictions sont en accord général avec les récentes études de désinfection UV222 et UV254 du SRAS-CoV-2 telles que récemment examinées29. Cependant, certaines de ces études sont encore en cours d'examen par les pairs et/ou n'ont pas utilisé de procédures de désinfection UV standardisées permettant des comparaisons entre les expériences et une quantification précise des doses. Dans la seule étude de décontamination de surface UV222 SARS-CoV-2 à ce jour36, les chercheurs rapportent 0,94 LR après 10 s d'exposition à 0,1 mW/cm2. Bien que la dose UV ne puisse pas être calculée pour cette étude en l'absence d'absorbance d'échantillon et de différences dans la configuration expérimentale, ces résultats démontrent un degré élevé de sensibilité du SRAS-CoV-2 aux UV222 et s'alignent généralement sur les nôtres.
Compte tenu de nos données dans le contexte de la littérature, UV222 est une méthode de désinfection prometteuse pour le SRAS-CoV-2 en solution aqueuse. Ces données sur l'infectiosité et la dose-réponse moléculaire pourraient éclairer immédiatement les mesures visant à prévenir la transmission potentielle par l'eau ou les eaux usées lorsque le SRAS-CoV-2 infectieux et d'autres virus se sont avérés potentiellement persistants pendant des jours37,38,39. Bien que des traînées aient été observées dans les doses-réponses pour les essais moléculaires et qu'elles puissent avoir été causées par l'agglutination du virus dans le milieu de croissance chargé de protéines, les virus ont été désinfectés en dessous de la détection dans les essais sur plaque, ce qui indique que l'agrégation n'interfère pas avec l'inactivation virale complète. Nous n'avons pas observé de relation forte entre la cinétique des dommages au gène N (mesurés par qPCR avec un amplicon court et long) et la désinfection, ce qui pourrait refléter que les dommages aux protéines contribuent davantage à la désinfection que les dommages au génome pour le SRAS-CoV-2. Une étude sur le bactériophage MS2 a révélé que les dommages du génome de l'ARN étaient étroitement liés à la cinétique de désinfection et y contribuaient donc15, tandis qu'une étude sur l'adénovirus a révélé que les dommages du génome de l'ADN n'étaient pas étroitement liés à la désinfection40. Cette disparité entre ces virus avec des structures et des hôtes différents a été davantage démontrée lorsqu'il a été démontré que les dommages protéiques, en particulier aux protéines de capside externes, contribuent plus fortement à la désinfection UV de l'adénovirus41. Cependant, nous n'avons pas non plus observé de forte association entre la cinétique des dommages aux protéines N et la désinfection. Parce que nous n'avons mesuré que la protéine N qui s'associe étroitement au génome viral, nous avons peut-être manqué des dommages aux protéines externes telles que la protéine de pointe qui sont à la surface pour absorber le rayonnement UV entrant et qui sont vitales dans l'infection des cellules hôtes42. Comprendre les impacts de l'UV222 sur la protéine de pointe n'a pas été possible lors de la réalisation de cette étude en raison de la disponibilité limitée des tests, mais continuera d'être important car les variantes du SRAS-CoV-2 avec des mutations de la protéine de pointe continuent d'émerger. De plus, la confirmation et la séquence du génome et des protéines peuvent affecter les dommages génétiques UV43,44,45,46,47, de sorte que la protéine N et le gène peuvent ne pas être les cibles qui contribuent principalement aux dommages moléculaires induisant la désinfection. Ces facteurs pourraient expliquer les faibles relations que nous avons observées entre la cinétique de désinfection et les dommages au gène N ou aux protéines N, et justifier une enquête plus approfondie pour démêler les mécanismes de désinfection à cette longueur d'onde UV et à d'autres. Bien que ces complexités mécanistes restent à résoudre, la cinétique de désinfection que nous rapportons indique le haut degré de sensibilité du SRAS-CoV-2 en solution aqueuse aux UV222.
Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.
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Ce travail a été soutenu par des fonds de l'Institut de durabilité de l'Ohio State University (OSU) ; Institut des maladies infectieuses de l'OSU ; Département de génie civil, environnemental et géodésique de l'OSU (président : Dr Allison MacKay); Département d'infection et d'immunité microbiennes de l'OSU (président : Dr Eugene Oltz ); et Instituts nationaux de la santé (U54 CA260582). Anna Herman d'AquiSense Technologies a partagé une liste de références aux études de désinfection UV SARS-CoV-2. La source de lumière UV222 (USHIO Care222®) a été fournie par USHIO, Inc. via l'accord de transfert de matériel 2020-2654 à Hull à OSU.
Département d'infection microbienne et d'immunité, Université d'État de l'Ohio, Columbus, OH, États-Unis
Richard T. Robinson, Najmus Mahfooz et Oscar Rosas-Mejia
Institut des maladies infectieuses, Université d'État de l'Ohio, Columbus, OH, États-Unis
Richard T.Robinson
Département de génie civil, environnemental et géodésique, Université d'État de l'Ohio, 2070 Neil Ave, Hitchcock 417C, Columbus, OH, 43210, États-Unis
Yijing Liu et Natalie M. Hull
Sustainability Institute, Université de l'État de l'Ohio, Columbus, OH, États-Unis
Natalie M. Hull
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RTR et NMH ont conçu l'étude et obtenu des fonds et des ressources. Tous les auteurs ont contribué à la collecte/analyse des données et à la génération des figures. RTR et NMH ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.
Correspondance à Natalie M. Hull.
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
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Réimpressions et autorisations
Robinson, RT, Mahfooz, N., Rosas-Mejia, O. et al. Désinfection UV222 du SRAS-CoV-2 en solution. Sci Rep 12, 14545 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18385-4
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Reçu : 10 mars 2021
Accepté : 10 août 2022
Publié: 25 août 2022
DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-18385-4
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